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四川大学华西医院骨科李箭和唐新教授团队:慢病毒介导的shRNAs下调大鼠骨关节炎leptin受体表达抑制软骨退变的研究

四川大学华西医院骨科李箭和唐新教授团队于2017年11月在Osteoarthritis Cartilage发表文章 “Lentiviral vector-mediated shRNAs targeting a functional isoform of the leptin receptor (Ob-Rb) inhibit cartilage degeneration in a rat model of osteoarthritis” (影响因子:4.879 )(长按下方二维码即可阅读原文)。




近年来,骨关节炎(osteoarthritis,OA)治疗方法得到大力发展,但治疗效果仍不够理想。瘦素(leptin)作为肥胖与OA之间的代谢性链接,是改善OA病情药物的潜在靶点。大量研究表明,通过抑制leptin的表达,可以显著改善OA的系列临床指标。然而,人体内脂肪组织和关节内软骨、滑膜、髌下脂肪垫及骨赘等均能分泌leptin。因此,仅阻断软骨细胞的leptin表达不足以完全阻止其对关节软骨的有害作用。我们设想,如果能通过阻断软骨细胞上的leptin受体(Ob-Rb)表达,可能更有效地阻断leptin对OA关节软骨的有害作用。基于此,本研究通过构建慢病毒介导的短发卡状RNA(lentiviral vector-mediated small hairpin RNA,LV-shRNA),下调大鼠关节软骨细胞Ob-Rb表达,探索Ob-Rb表达下调对OA关节软骨退变和OA相关因子表达的影响。。。。。。四川大学华西医院骨科李箭和唐新教授团队于2017年11月在Osteoarthritis Cartilage发表文章 “Lentiviral vector-mediated shRNAs targeting a functional isoform of the leptin receptor (Ob-Rb) inhibit cartilage degeneration in a rat model of osteoarthritis” (影响因子:4.879 )(长按下方二维码即可阅读原文)。。。。


体外研究:优化转染条件后,使用最佳LV-shRNA3和阴性对照慢病毒LV-NTC转染软骨细胞,采用qRT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测转染后的软骨细胞Ob-Rb表达,以及相关前炎性因子、合成代谢因子和分解代谢因子的表达情况。


结果显示,LV-shRNA3显著降低大鼠关节软骨细胞Ob-Rb表达。与LV-NTC组相比,LV-shRNA3组前炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达显著降低;合成代谢因子COLⅡmRNA表达显著升高;分解代谢因子ADAMTS-5、MMP-9、COX-2和NOS-2 mRNA表达显著降低。见图1、2。



图1 Western blot检测示优化的LV-shRNA3显著降低大鼠关节软骨细胞Ob-Rb表达



图2 qRT-PCR检测显示LV-shRNA3显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、ADAMTS-5、MMP-9、COX-2和NOS-2 mRNA表达,增加COLⅡmRNA表达


体内研究:96只SD大鼠随机分为假手术组、空白对照组、阴性对照组和实验组。后三组大鼠制备OA模型后,分别注射PBS、LV-NTC以及LV-shRNA。术后2、4、8、12周取各组膝关节软骨行甲苯胺蓝染色,采用国际骨关节炎研究协会-骨关节炎软骨组织学评分系统(OARSI)进行评分;取术后4周关节软骨行OA相关因子免疫组织化学染色分析。


结果显示,与空白对照组相比,实验组术后4、8、12周大鼠膝关节软骨OARSI评分显著降低;术后4周Ob-Rb表达水平显著降低,ADAMTS-5和MMP-9的表达也显著降低,而软骨基质中COLⅡ的表达水平升高。见图3、4。



图3 术后4、8、12周各组大鼠膝关节软骨甲苯胺蓝染色及OARSI评分



图4 术后4周各组Ob-Rb免疫组织化学染色和半定量分析 


结论  

LV-shRNA3下调关节软骨细胞Ob-Rb表达后,可以明显抑制大鼠OA模型关节软骨退变,表明Ob-Rb可能是OA治疗的一个潜在靶点。


专家点评


康鹏德教授:肥胖是诱发OA的重要因素之一,leptin被认为是肥胖与OA发生之间的一个重要蛋白, leptin通过与关节软骨表面受体(Ob-Rb)结合,导致软骨代谢分化异常、软骨破坏诱发OA,对其干预、调控有望成为预防、治疗肥胖相关OA的一个重要靶点。李箭、唐新团队在前期研究基础上,通过构建LV-shRNA3阻抑关节软骨细胞表达Ob-Rb,进而影响相关炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6,以及软骨合成与分解代谢相关因子COLⅡ、ADAMTS-4、ADAMTS-5、 MMP-9、COX-2、NOS-2等的表达,最终调控软骨细胞代谢。体内研究表明,阻抑Ob-Rb表达可有效地阻断leptin对OA关节软骨的损害作用,减缓或预防大鼠OA发生及OA程度。


此研究结果能在Osteoarthritis Cartilage发表主要基于以下因素:①良好的前期研究基础和相关研究积累铺垫;②科学问题、科学假设具有较好的科学性和创新性;③研究设计合理、方法正确,结合先进的研究手段验证所提科学问题,体外、体内研究逐步深入;数据详实、充分,表格设计合理,图片清晰;④论文撰写逻辑清晰,讨论重点突出,语言流畅,英文撰写规范、严谨、科学。此研究对于揭示肥胖与OA发生、发展的分子病理机制、对探索研究OA 治疗新的靶点提供重要的理论依据,对于开发OA预防、治疗药物具有一定借鉴和指导价值。



康鹏德,四川大学华西医院骨科教授,主任医师,博士研究生导师。中华医学会骨科专委会关节外科学组委员、髋关节学组委员,中国医师协会骨科分会关节外科专委会委员、髋关节学组委员、国际骨循环与骨代谢协会(ARCO)会员、中国区常务委员,中国医师学会显微外科医师学会骨坏死显微外科修复委员会副主任委员,四川省卫生计生委学术技术带头人,四川省医学会骨科委员会青年委员会副主任委员。《中华骨科杂志》、《中国矫形外科杂志》、《中国骨与关节损伤杂志》、《中国组织工程研究与临床康复杂志》编委。国家自然科学基金面上项目、二审评审专家。 先后主持国家自然科学基金面上项目5项,教育部、人事部博士后基金各1项,四川省科技支撑计划项目2项;参与国家十一五科技支撑计划项目1项;获得国家发明专利4项,实用新型发明专利2项。发表论文150余篇,其中SCI收录70余篇。


作者投稿心得


此研究属于国家自然基金支持项目。由于本研究部分结果未完全达到预期,文章撰写之初研究团队部分人员对文章质量信心不足,认为该文只能发表在一般杂志。然而,本课题的负责人坚持认为本研究具有较高创新性,且目前研究结果远远走在前沿,足以支持预期设想,因此主张先投学科领域最高杂志Osteoarthritis Cartilage。文章撰写时我们不回避部分研究结果未达预期这一事实,投稿前经团队人员反复论证和修改,投稿后经历一轮大修后很快被接受。此次文章发表极大鼓励了研究团队的信心,通过这次投稿,我们认为对于任何类型研究,只要努力用心,即使结果不完全尽如人意,但是只要把握了当前热点问题,敢于“亮剑”,成功的机会仍然很大。


通信作者



唐新,四川大学华西医院骨科副主任医师,留美访问学者。专业:骨科运动医学。研究方向:肩、膝关节运动损伤疾病的发病机制与诊治临床及基础研究;膝关节骨关节炎的发病机制及治疗的相关基础研究。目前以负责人身份获得国家自然基金青年基金1项,省科技厅课题2项,参与省部级课题近10项。第一作者在国内外期刊发表论文近30余篇,其中SCI文章13篇,参编专著2部。学术任职:中华医学会骨科分会关节镜学组委员;中华医学会运动医疗分会青年委员;中国医师协会内镜医师分会关节镜委员;中西医结合科骨伤科分会运动损伤与关节镜委员;中国肢残康复专业委员会运动损伤康复学组委员;中国医药教育协会肩肘委员会规范化培训四川中心常务副主任委员;中国医学救援协会运动伤害分会理事;中国西部运动医学关节镜联盟会委员;四川省运动医疗青年委员会副主委;四川省骨科专委会关节镜学组委员;BJSM 中文版青年编委。


第一作者



邓森林,四川大学华西临床医学院/华西医院2017届博士毕业生,导师为骨科副主任/运动医学中心主任李箭教授,指导老师为骨科运动医学唐新副教授,在读期间协助完成唐新副教授主持的国家青年科学基金“SiRNA下调软骨细胞leptin受体表达抑制骨关节炎关节软骨破坏研究”,以第一作者发表SCI论文3篇。

团队简介



四川大学华西医院运动医学中心


四川大学华西医院骨科前辈龚锦源教授自20世纪60年代从事运动创伤诊治工作,并于80年代开展关节镜手术,是开创我国关节镜外科事业的元勋。李箭教授于1996年成立了中国西部关节镜外科技术培训中心,2000年组建骨科运动医学/关节镜亚专科,2013年成立了华西医院运动医学中心,目前已发展成为西部最具影响力的综合性运动医学中心,集医疗、教学及科研为一体,是国家重点硕士及博士研究生培养点,已培养研究生50余名。现在,中心有教授兼博士导师2人、副教授3人、主治医师3人、住院医师3人,年门诊量近2万人次,年手术量达近2 000余台次,居四川省乃至西部地区首位。目前,中心拥有世界先进的关节镜设备、导航及膝关节稳定度测试仪、步态分析仪等设备;全面开展膝、肩、踝、髋、肘、腕、指间关节以及关节外创伤与疾病的微创、关节镜手术诊断和治疗,具有创伤小、痛苦少、恢复快、住院时间短、费用低等优点;现已累计完成手术10 000余台次,患者遍及全国各地乃及世界其他国家地区(香港、马来西亚、美国、加拿大、意大利、西班牙、比利时及非洲等),得到同行及患者的认可、好评。中心在国际上首创多种治疗方法,累计负责、主研及完成国家、省部级及横向科研课题20余项,参与获得科技成果3项;在国内外各级期刊共计发表论文近200余篇;参编专著以及国家规划教材等12部;多次获得省市科技奖一等奖。已获10项国家专利,拟申报省及国家级科研成果2项。



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本文编辑:刘 丹

本文排版:陈红梅 张洪雪

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